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腺病毒冻干、腺病毒冷冻干燥技术方法路线

时间:2022-08-11 点击次数:209

腺病毒于1953年从人的增殖腺分离出来的,是一种无包膜的DNA病毒,可感染人和畜禽,对呼吸道、胃肠道、尿道膀胱、眼、肝脏等均可感染,人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关,但一种血清型可引起不同的临床疾患;相反,不同血清型也可引起同一种疾患。腺病毒是呈二十面体对称的线性双链病毒,病毒颗粒直径约65~80nm,由蛋白衣 壳、核心蛋白和DNA组成,腺病毒科分为哺乳动物腺病毒属和禽类腺病毒属,具有严格的寄主特异性,不感染其他动物,迄今共发现100余个血清型,其中人腺病毒有57种,分为7个亚群。

腺病毒生产工艺简单成本低,对人致病性小且不诱导癌变,繁殖滴度高,装载容量大,可以高效转移外源基因至靶细胞中,使其在细胞内表达,产生体液和细胞免疫,因此,重组腺病毒载体广泛应用于基因治疗、疫苗开发等生物制药领域中。

重组腺病毒载体疫苗作为一种新型疫苗,在各种人和动物病毒病,细菌病和寄生虫病、癌症的免疫预防中进行了大量研究。但是腺病毒载体的应用具有局限性:

1、腺病毒对反复冻溶敏感,容易失活,且热稳定性差,通常将腺病毒保存于含有 10%甘油的缓冲液中,并于-80℃条件下存储和运输,以保证腺病毒的活性。-80度运输、保存为腺病毒的发展和推广带来不方便。

2、临床使用时也要求低温,通常在干冰上进行,限制了其使用范围和条件。

3、因为保存时添加了大量的甘油,需要大量稀释以减轻甘油的毒性和肌肉注射的疼痛感。

4、温度的敏感性给运输、保存、使用都提出了极大的挑战,因此发展一种冷藏条件下可以运输或者使用的腺病毒载体是新的趋势。

由于以上局限性,因此腺病毒冻干、腺病毒冷冻干燥法的应用开始大量开展。冻干法制备腺病毒,就是将腺病毒载体溶液预先冻结成固体,然后在低温低压下进行升华干燥,进一步升温进行解析干燥,最终获得含水量合格活性保持合格的病毒载体制剂。通过冷冻干燥法制备腺病毒载体制剂具有很多优点:

1、冻干是在低温低压下进行的,避免了高温对病毒载体的破坏,特别是腺病毒是温度敏感性物质。

2、避免氧气氧化有效成分。

3、形成了疏松多孔的结构,具有一定的组织结构和形态骨架。

4、复溶速度快,使用方便。

5、含水量低,适合长期保存和冷藏运输等,运输和保存的成本大大降低。

冻干法优点很多,但是很多冻干的药品、试剂、微生物等都不能直接冻干,因为冻干过程中也有一定机械效应、溶质效应、脱水效应等,可能导致冻干后活性降低,含量偏低、塌陷、开裂等问题,要达到理想的冻干效果,需要合适的冻干曲线和好的冻干配方保护剂,配合性能稳定的冻干设备才能达到理想的效果。为了选择合适的冻干曲线和冻干保护剂,需要根据冻干后的外观、性状、效价、含量、检测的安全性、保存时间等进行相应的不断调整配方保护剂和优化冻干曲线。

   腺病毒冻干的保护剂和其他生物制剂冻干一样,常用的也是包含糖类、多元醇类、氨基酸、表面活性剂、聚合物和无机盐等化合物。主要的方法也是一样的,进行配方的筛选组合,通常腺病毒的保护剂筛选主要注意1、保护剂要无免疫原性,没有毒性,不能对后期的使用产生有害的影响。

2、保护剂应该容易溶解,不容易起泡,不产生沉淀,不容易结晶。

3、冻干过程和冻干后都可以起到相应的保护作用。

4、不和里面成分发生化学反应,不影响冻干后的活性、检测、安全性等。

5、尽量选择关键温度高的保护剂。

推荐腺病毒冻干常用保护剂如海藻糖、甘露醇、蔗糖、甘氨酸、谷氨酸纳、人血白蛋白、右旋糖苷、山梨醇、吐温80、明胶、PVP、磷酸盐缓冲液等。采用何种比例,需要根据冻干后的评价进行优化筛选。


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