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冻干法制备菌种:微生物菌种真空冷冻干燥保存法

更新时间:2024-08-15 点击次数:1167

微生物菌种可以采用冻干法进行保存。冻干法制备的菌种具有保存周期长,易活化,保存存活率高。具体方法步骤如下:

1准备安瓿瓶用于真空冷冻菌种保藏安瓿瓶宜采用中性玻璃制造形状可用长颈球形底的。大小要求外径6~7.5mm,长105 mm,球部直径9~11 mm,壁厚0.6~1.2 mm,也可用没有球部的管状安培管。先用2%盐酸浸泡8~10h,再经自来水冲洗多次,用蒸馏水涮洗2~3次,烘干;在每管内放入打好菌号及日期的标签,字面朝向管壁,管口塞好脱脂棉塞,121℃下高压灭菌20分钟备用。

2准备菌种用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年为了活性高,保存期长,所用菌种纯度要高而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期若用对数生长期的菌种进行保藏其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求24~48h酵母菌为3d形成孢子的微生物则宜保藏孢子放线菌和丝状真菌菌龄为7~10d。

3保护剂的选择和准备选取新鲜牛奶作为保护剂牛奶采用脱脂牛奶,用离心方法去除上层油脂115℃下高压蒸汽灭菌25min,备用。或者采用微生物专用冻干保护剂配方可以保持更高的活性。我公司针对微生物冻干开发保护剂,确保微生物高活性冻干。

4菌种准备及分装菌种每支长好的斜面加2~3ml保护剂用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基制成菌悬液。如用液体培养的菌种,则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到108~1010/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌滴入安瓿管底部每管分装量约0.1~0.2毫升分装安瓿管时间尽量要短最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

5预冻-80℃冰箱预冻1~2小时或者在冻干机内预冻3-6个小时

6冷冻干燥将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内开始冷冻干燥时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断:①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状;②真空度接近空载时的极限真空③选用1-2支对照管其水份与菌悬液同量视为干燥完结。

7封口抽真空干燥后取出安培瓶接在封口用的玻璃管上可用L形五通管继续抽气,约10min即可达到26.7Pa(0.2mmHg。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。

8保藏安瓿管保藏在-20℃冰箱里。

9、冻干法保存的菌种活化如果要从中取出菌种恢复培养,可先用75%酒精将管的外壁消毒用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端使管子破裂在安瓿管中加入0.5~1ml液体培养基慢慢旋转安瓿管使冻干菌种复水然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。冻干法保存的菌种方便活化,活性高。


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