微生物菌种可以采用冻干法进行保存。冻干法制备的菌种具有保存周期长,易活化,保存存活率高。具体方法步骤如下:
1、准备安瓿瓶用于真空冷冻菌种保藏。安瓿瓶宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的。大小要求外径6~7.5mm,长105 mm,球部直径9~11 mm,壁厚0.6~1.2 mm,也可用没有球部的管状安培管。先用2%盐酸浸泡8~10h,再经自来水冲洗多次,用蒸馏水涮洗2~3次,烘干;在每管内放入打好菌号及日期的标签,字面朝向管壁,管口塞好脱脂棉塞,121℃下高压灭菌20分钟,备用。
2、准备菌种:用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年。为了活性高,保存期长,所用菌种纯度要高,而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求24~48h。酵母菌为3d,形成孢子的微生物则宜保藏孢子。放线菌和丝状真菌菌龄为7~10d。
3、保护剂的选择和准备:选取新鲜牛奶作为保护剂,牛奶采用脱脂牛奶,用离心方法去除上层油脂,115℃下高压蒸汽灭菌25min,备用。或者采用微生物专用冻干保护剂配方可以保持更高的活性。我公司针对微生物冻干开发保护剂,确保微生物高活性冻干。
4、菌种准备及分装菌种:每支长好的斜面加2~3ml保护剂,用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基,制成菌悬液。如用液体培养的菌种,则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞,收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到108~1010个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌滴入安瓿管底部,每管分装量约0.1~0.2毫升,分装安瓿管时间尽量要短,最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
5、预冻-80℃冰箱预冻1~2小时或者在冻干机内预冻3-6个小时。
6、冷冻干燥:将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内,开始冷冻干燥,时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断:①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状;②真空度接近空载时的极限真空。③选用1-2支对照管,其水份与菌悬液同量,视为干燥完结。
7、封口抽真空干燥后,取出安培瓶,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管继续抽气,约10min即可达到26.7Pa(0.2mmHg。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。
8、保藏安瓿管保藏在-20℃冰箱里。
9、冻干法保存的菌种活化:如果要从中取出菌种恢复培养,可先用75%酒精将管的外壁消毒,用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端,使管子破裂,在安瓿管中加入0.5~1ml液体培养基,慢慢旋转安瓿管,使冻干菌种复水,然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。冻干法保存的菌种方便活化,活性高。