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冻干添加剂对PCR体系冻干的影响

时间:2020-05-27 点击次数:798

随着医疗事业的快速发展,PCR试剂,荧光PCR试剂等的冻干迅速崛起。很多企业在开发PCR试剂的冻干。PCR试剂的冻干就是配制的液态PCR检测体系添加冻干保护剂(包括赋形剂)后,先预先冻结为固体,在真空条件下,利用物质的升华,使物料低温脱水而达到试剂干燥的目的。在冷冻干燥过程中热敏性物质(如酶、dntp等)不会发生变性或失活,能保持原来的活性;冻干前后试剂体积变化很小,保持了原来的结构;干燥过程在真空下进行,氧气极少,易氧化的物质能够得到保护;冷冻干燥能排除95%~99%以上的水分,使干燥后产品能长期保存而不致变质。冷冻干燥整个干燥过程在低温中进行,PCR试剂活性不会受到影响。因此与常规液态PCR试剂相比冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链、即时活化、不相容试剂共存、无交叉污染等很多明显优势。

     所有的冻干包括药物的冻干和试剂的冻干,原理都是一样的,都是在含有保护剂的情况下,将我们要保护的试剂或者物质进行冻干。其中冻干保护剂起了很大的作用,如果没有冻干保护剂的添加,很多物质是不能完好的冻干的。冻干保护剂使得本来不适合冻干的物质能够获得良好的冻干状态。常见的冻干保护剂包括:糖类、醇类、氨基酸类、聚合物类、表面活性剂类、盐类、大分子活性物质类等,这么多的种类应该如何选择呢?对于冻干保护剂的选择不一定,冻干的曲线不一样,冻干的本体物质的浓度不一样,反应体系不一样,所以最终冻干的结果,冻干的时间成本等是不同的。而对于冻干保护剂有些通用的常用的物质如海藻糖、蔗糖、甘露醇、PEG、pvp等。但是除了这些常用的还有很多如甘油、乳糖、半乳糖、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、右旋糖苷、吐温80、吐温100、环糊精、明胶、维生素C、维生素B、牛血清、二硫苏糖醇、吐温20、明胶等,这些都是很好的冻干保护剂或者赋形剂。因此对于同一个试剂的冻干可以选择的冻干保护剂是很多的。

  冻干保护剂的筛选看似简单,但是需要大量的工作量,如果想获得一个高效稳定的PCR冻干体系,需要进行大量的实验,保护剂的筛选实验,冻干曲线的优化实验等。先选择种类浓度,再进行优化组合。同样组分的保护剂用在不同的PCR反应体系可能冻干的曲线,冻干的质量都会有差别,这是由于本体物质不一样,实验的条件也不完全一样,因此对于冻干没有一个通用的保护剂,需要针对自身的反应体系进行开发。

叔丁醇是一种特殊的冻干保护剂加速剂,可以起到冻干保护剂、赋形剂和加速剂的作用。如《一种冻干添加剂及荧光PCR反应混合物干粉 和制备方法》所述加入叔丁醇做保护剂的荧光pcr反应体系的效率能大大提高,而且预冻温度,升华温度,解析温度都能大大提高,如作者所述叔丁醇在PCR试剂分装好准备冻干之前按体积比加入, 混合后可提高混合物共晶点15-20度,在冻干显微镜下,叔丁醇升华后形成的微通道有利于 水分的析出,也加快了升华解析的速度。通过对保护剂的筛选优化,荧光PCR反应混合物含有冻干添加剂,不仅扩增性能好,又节省冻干时 间,显著的优点在于: 1、提高了共晶点,预冻温度从常见的-40℃~-30℃提高到-15℃; 2、冻干时间仅需3小时;3、冻干的成品在试剂管中形态完整,晃动不易碎; 4、冻干组分复溶良好,并且有良好的稳定性。从以上可以看出经过优化的冻干保护剂和冻干曲线效率大大提高,而对于常规的保护剂未优化的保护剂和冻干曲线,一般的PCR反应体系的冻干时间在24小时,而经过优化筛选后效率可以大大提高,而对于有的可能酶的冻存过程中添加了一定的保护剂,保护剂浓度合适可能不需要再添加保护剂也可以很容易的冻干。冻干保护剂属于冻干配方辅料的筛选,对于很多物质的冻干是不可或缺的。制药和试剂冻干基本上都需要添加一种或者多种保护剂。

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